外显子捕获

编辑:主要网互动百科 时间:2020-04-01 07:00:40
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外显子捕获
外显子捕获(exon trapping) 是构建一种载体,从其插入片段中识别和回收外显子序列,从而克隆目的基因。捕获外显子的载体pETV—SD是一种反转录病毒穿梭载体,即可在不同种生物中如大肠杆菌和酵母,细菌和哺乳动物细胞等进行复制的载体因为凡是有内含子和外显子的基因在转录后都要经过RNA剪接,这就需要有剪接供体(splicing donor,SD)位点和剪接受体(splicing acceptor,SA)位点。因此,SA位点可作为基因的标志。pETV—咀载体的克隆位点上游有一个“外显子捕获序列”(exon trap cassette),可用来识别载体的插入片段中有无SA位点。
中文名
外显子捕获
外文名
exon trapping
方    法
构建一种载体
目    的
克隆目的基因

外显子捕获操作步骤

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(1)基因组DNA经“霰弹法”切成小片段后,克隆在位于“外显子捕获序列”下游的克隆位点上。
(2)将这些重组载体汇总后感染反转录病毒的专宿包装细胞系(ecotropicretroviral packaging cell line)——ψ2细胞系。ψ2细胞提供蛋白质产物使载体(自身不能合成病毒蛋白质)成为反转录病毒在细胞里增殖。当反转录病毒在细胞内转录时,如果插入片段中包含有功能的SA位点,则有可能发生RNA剪接反应而将IVS切除。
(3)已剪接和未剪接的病毒RNA都包装在病毒子(virion)中,从细胞培养液中收集后用来感染兼宿反转录病毒包装细胞系(amphotropic retroviral packagingcell line)PA-317。这使反转录病毒再进行一轮复制,并产生能感染猴肾细胞系COS细胞的高效价病毒原种。这样做是由于上一轮克隆在病毒中的插入片段的剪接效率极低,而在第二轮复制时则大大提高了RNA剪接的机会。
(4)从第二个细胞系PA-317细胞中分离得到的病毒,用来感染组成型产生SV40T(肿瘤)抗原的COS细胞。病毒RNA基因组被反转录,并在载体上的SV40复制起点作用下,以环状DNA附加体形式进行复制。

外显子捕获基本原理

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(5)从COS细胞中回收复制的附加体DNA,经限制性内切酶Dpn I 酶切后转化细菌。在含卡那霉素(Kn)和5—氯—4—溴—3—吲哚—β—D—半乳糖苷(X-gal)的培养基上挑选转化子。卢—半乳糖苷酶可水解X—gal而生成蓝色产物。因此,不产生β—半乳糖苷酶的转化子菌落则呈白色。
(6)只挑选出白色菌落作进一步研究的材料。白色菌落的生成可以有二种原因。一是由于基因发生突变,使夕—半乳糖苷酶失去活性;二是由于在反转录病毒生活周期的RNA时期中发生了剪接反应,从而丢失了α,β—半乳糖苷酶基因。
(7)如果是基因突变,则大多数将是缺失了载体中的“外显子捕获”部分,就可用人的口—珠蛋白基因片段为探针作菌落杂交,很快可得到验证。
(8)如果是真正发生了RNA剪接事件,准确的剪接反应可切除作为标记的IVS,使人口—珠蛋白基因的第1外显子与落入了捕获陷阱的插入片段中的外显子序列连接,这可直接测定其序列加以证明。
从捕获到的外显子出发,就可进一步用作探针去从基因组基因文库或cDNA文库中分离出基因。
词条标签:
理学